Phương pháp điện di
1. Nguyên lý
Protein là những phân tử tích điện, khi đặt trong điện trường, sẽ di chuyển về phía điện cực trái dấu với chúng.
2. Độ di động điện di
Khi một hạt tích điện Ne đợc đặt trong điện trường E, nó chịu một lực F được tính theo định luật Coulomb:
F = Ne . E
Hạt sẽ di chuyển và đạt tới vận tốc giới hạn v khi lực ma sát bằng lực Coulomb:
f. v = - Ne. E
Độ di động điện di của hạt đợc tính nh sau:
m = v/E = Ne/F
Đối với các phân tử đơn giản, đợc coi là hình cầu, nh protein globulin của huyết thanh, hệ số ma sát f có giá trị là:
f = 6. p.h.r
trong đó r là bán kính của cầu và h là độ nhớt của dung môi.
Thực tế, các phân tử protein đợc bao bọc bởi một lớp ion và nớc, làm biến đổi điện tích thực và bán kính của nó. Vì vậy, để trao đổi ion, pH phải lớn và phải xa pH đẳng điện - pHi (ở pHi hạt không di chuyển). Ví dụ nh, tất cả protein huyết thanh di chuyển trong điện trờng về phía cực dơng (anode) khi đợc đặt ở pH= 8,6.
Dòng gây nhiễu:
Trên một chất giá rắn, có các hiện tợng khác can thiệp vào độ di động thực của phân tử:
- Dòng điện thẩm thấu (electro-osmose): khi đặt một hiệu điện thế giữa hai đầu của một đoạn chất rắn đợc thấm ớt bởi chất điện ly, sẽ có sự di chuyển của dung môi về một trong các cực, do sự tạo thành một lớp điện tích, thường là âm, ở bề mặt của các kênh của bề mặt lỗ. Khi đó, chất điện ly có thừa điện tích dơng và sẽ di chuyển về phía cực âm (cathode). ảnh hưởng này phụ thuộc vào điện thế cuả lớp kép đợc tạo ra ở bề mặt của mao quản. Điện thế này lại phụ thuộc vào bản chất của chất có lỗ đợc dùng, vào điện trờng đợc đặt, vào lực ion của chất điện ly và độ nhớt của chúng. Có thể hạn chế đáng kể hiện tợng này bằng một số cách, nh dùng một màng bán thấm để bọc chất giá ở mức độ điện cực, hoặc dùng một dòng thuỷ động ngược và chất bù trừ.
- Dòng điện đối lu (electrorheophorese): là một dòng hơi do sự bốc hơi của dung môi bởi nhiệt. Để hạn chế hiện tợng này, khi chạy điện di điện thế thấp (230 V) dùng trong thực hành lâm sàng hàng ngày, ngời ta dùng nắp có mái để đậy máy; còn khi chạy điện di điện thế cao (trên 1000 V), ngời ta phải đặt trong hệ thống làm lạnh.
4. áp dụng
- Có nhiều kiểu điện di được dùng trong phòng thí nghiệm cũng nưh trong công nghiệp, tuỳ theo mục đích và điều kiện phân tích. Trong hóa sinh y học thường ngày, điện di thờng đợc dùng để phân tích các protein huyết thanh, nước tiểu cũng như các dịch sinh học khác. Sự di chuyển của protein phụ thuộc vào bán kính r của nó, vào pH đẳng điện - pHi (pH mà ở đó, protein không mang điện tích hay có tổng điện tích âm bằng tổng điện tích dương)
- Để nhận biết các protein đã phân chia, ngời ta dùng nhiều phơng pháp tuỳ theo kỹ thuật điện di được sử dụng:
. Thông dụng nhất là dùng các chất nhuộm màu đặc hiệu (đỏ Ponceau, Amido đen, xanh Croomassie…), sau đó định lượng các phần đã phân chia.
. Dùng kỹ thuật miễn dịch nhậy và đặc hiệu.
Các acid nucleic cũng có thể phân chia bằng điện di, nhưng gần đây người ta thường dùng các kỹ thuật sinh học phân tử hơn.
• - Phân tích kết quả: Bằng densitometor
Densitometor cho phép đọc mật độ quang học của các băng và biểu thị theo nguyên lý đo quang phổ. Cấu tạo của densitometor gồm: nguồn sáng, kính lọc (có bước sóng thích hợp với màu của băng), bộ nhân quang, bộ ghi, bộ tính toán và bộ in.
Khi chiếu ánh sáng đơn sắc vào băng màu, một phần ánh sáng bị hấp thụ, phần còn lại bị phản xạ. Phần hấp thụ càng lớn khi mật độ chất màu ở băng màu càng lớn và do đó phần phản xạ càng nhỏ. Đo ánh sáng phản xạ và biến đổi thành dòng điện đo được sẽ xác định đợc mật độ chất màu
5. Các phương pháp điện di
5.1. Điện di trong lòng dịch và điện di giấy,
- Điện di trong lòng dịch: đã đợc Tiselius mô tả đầu tiên để phân chia protein huyết thanh. Hiện nay, nó không còn đợc dùng nữa , nhng vẫn còn được xem như một qui chiếu để đo độ di động điện di thực, vì không có dòng thuỷ động gây nhiễu và không có sự can thiệp của chất giá.
- Điện di giấy: Giấy là chất giá rắn được dùng lần đầu tiên, nhng nay ít dùng vì đã có các chất giá có khả năng giải quyết tốt hơn và thực tế hơn, song nó vẫn có những u điểm (ví dụ, trong phân loại rối loạn lipoprotein máu theo Fredrickson)
5.2. Điện di trên màng cellulose acetat
Màng cellulose acetat là chất giá quen thuộc để phân chia protein huyết thanh trong xét nghiệm hàng ngày. Chấm một lượng nhỏ huyết thanh trên màng cellulose acetat dới dạng một vạch nhỏ bằng bộ chấm mẫu chuyên dụng. Sau khi chạy điện di (khoảng 30 phút ở 230V) và nhuộm các protein, màng được làm trong bằng sấy khô, rồi đọc kết quả trên máy đo mật độ (densitometor)
5.3. Điện di trên gel
5.3.1.Điện di trên gel acrylamid :
Phơng pháp này sử dụng một gel có lỗ thu được bằng sự copolymer hóa acrylamid và N-N’-methylen bis-acrylamid nhờ một phản ứng gốc dới ánh sáng với sự có mặt của một chất xúc tác như persulfat ammon hoặc riboflavin.
Kích thước của lỗ gel phụ thuộc vào tỷ lệ tơng đối giữa hai thành phần trên và vào acrylamid. Các gel acrylamid dùng để phân chia protein huyết thanh thờng chứa 7-12% acrylamid. Có thể tạo ra gradient nồng độ acrylamid liên tục (ví dụ, từ 4 đến 30%) hoặc không liên tục.
Các gel acrylamid dễ chuẩn bị trong các phòng xét nghiệm, nhng cần thận trọng vì acrylamid là một chất độc thần kinh.
Có nhiều kỹ thuật đợc dùng:
+ Điện di gel trong ống thuỷ tinh (điện di cột): (a) thờng dùng ống dài 5-10 cm, đờng kính 0,5- 0,8 mm.
+ Điện di gel giữa hai tấm thuỷ tinh (b) hoặc điện di phiến gel (slab - gel electrophorese): cho phép so sánh dễ dàng giữa các mẫu thử vì đợc tiến hành trong cùng điều kiện giống hệt nhau.
Kích thước của tấm có thể thay đổi: thường rộng từ 8-15 cm, cao 8-20 cm. Các gel được dùng để xác định trình tự của acid nucleic thì dài hơn (30-40 cm) so với để phân chia protein. Chiều dày của gel thờng dùng là 0,75 đến 2,5 cm. Các hố được đục nhờ một que nhựa nhét vào giữa hai tấm thuỷ tinh khi polymer hóa. Trên thị trường có bán các tấm có sẵn để dùng.
+ Điện di gel trên phim nhựa: Mẫu thử đợc đặt trong các hố nằm trong gel hoặc ở bề mặt gel để khuếch tán trong gel trước khi đặt trong điện trường.
Điều kiện điện di:
Trong lưới gel acrylamid, các phân tử được phân chia theo kích thước (trọng lượng phân tử) và điện tích của chúng. Do đó có hai kiểu điện di đợc dùng:
. Điện di không biến tính: Trong một gel có lỗ hằng định, cả hai thống số kích thớc và điện tích đều can thiệp vào sự di chuyển của các protein. Còn trong một gel với gradient của acrylamid thì chỉ có kích thước là thông số can thiệp: các protein không qua được lỗ do kích thớc của chúng lớn hơn kích thớc lỗ. Đối với các lipoprotein, người ta dùng một gel với 2 lớp acrylamid có nồng độ khác nhau (gradient không liên tục): lớp thứ nhất, nồng độ thấp hơn, có lỗ lớn hơn, chỉ cho các phân tử lớn (chylomicron) đi qua; lớp thứ hai có nồng độ acrylamid cao hơn, giữ lại các phân tử nhỏ hơn một chút (VLDL) và cho qua các phân tử nhỏ mà khi phân chia theo kích thước và điện tích của chúng sẽ thành LDL và HDL. Như vậy, người ta tách được các lipoprrotein thành 4 lớp có ý nghĩa chẩn đoán và tiên lượng khác nhau. Sự phân chia cũng được thực hiện bằng kỹ thuật siêu ly tâm nhưng có thể thực hiện với nhiều mẫu thử, tốn ít thời gian và dùng ít mẫu hơn.
Điện di biến tính: Làm biến tính các protein bằng cách đun nóng trong dung dịch chứa các chất khử (nh b-mercapto-ẹthanol) để cắt các cầu disulfua và một chất tẩy, natri dodecyl-sulfat (SDS).
SDS gắn với bề mặt protein làm cho chúng tích điện âm. Sự di chuyển của protein trong gel acrylamid thực tế chỉ phụ thuộc duy nhất vào trọng lợng phân tử của chúng. Phương pháp này đơn giản, nhanh, chính xác và thực tế được dùng thay cho phần lớn các phương pháp lý học (siêu ly tâm phân tích, khếch tán ánh sáng…) trong xác định trọng lượng protein. Gần đây, cetyl-triammon-bromua (CTAB) đã đợc đề nghị sử dụng thay cho SDS, vì nó tương đối giữ được hoạt tính sinh học sau khi điện di, còn SDS thì không.
5.3.2. Điện di trên các gel khác:
Gel tinh bột và gel agarose thu đợc bằng đun nóng sau đó làm lạnh là những polymer glucid. Nó không có tác dụng sàng phân tử nh acrylamid, nhưng kích thước lỗ lớn của gel cho phép nhận biết enzym. Vì so với giấy hoặc màng cellulose acetat, chiều dày của gel cho phép chứa một lượng mẫu thử lớn hơn
5.4. Điện di hội tụ (Electrofocalisafion)
Đó là một kiểu điện di thực hiện trong gradient pH. Các thành phần di chuyển theo điểm đẳng điện và dừng lại ở vùng có pH tơng ứng với pH đẳng điện của chúng. Gradient pH đợc tạo ra trong quá trình điện di bởi một hỗn hợp của một số lớn các hạt aminoacid có pH đẳng điện khác nhau (ampholytes). Tuỳ theo thành phần của hỗn hợp, người ta thu được một thang pH nào đó và nh vậy một khả năng giải quyết tốt hơn.
Có thể thực hiện theo 2 cách:
- Hoặc trong môi trường lỏng, trong cột, gradient đợc tạo ra bởi gradient saccharose.
- Hoặc trong môi trường rắn: trên một gel (agarose hoặc acrylamid).
Anode đợc tạo bởi acid, còn cathode đợc tạo bởi một base. Sử dụng điện thế rất lớn: 1 000 đến 2 000 V và cần hệ thống làm lạnh.
Phương pháp này đợc dùng trong nghiên cứu vì khả năng giải quyết của nó trong hóa sinh protein rất lớn.
5.5. Điện di hai chiều (Electrophorese bidimensionnell)
Thực hiện 2 lần điện di theo 2 hướng vuông góc với nhau. Có thể kết hợp điện di acrylamide-agarosse, điện di đơn và điện di hội tụ….Trong thực hành, đầu tiên người ta thực hiện điện di hội tụ theo một hướng, rồi điện di gel acrylamide-SDS theo hớng thứ hai.
5.6. Điện di mao quản (Electrophorese capillaire)
Gel acrylamide hoặc gel khác bền trong môi trường điện di và hạn chế được độ rộng của băng khi phân chia. Các mao quản (có đường kính trong từ 10-100mm) cho phép phân chia trong một thời gian ngắn và giá rẻ hơn. Dùng mao quản sẽ làm tăng tỷ lệ bề mặt/thể tích làm cho dễ thoát nhiệt đợc sinh ra khi điện di và hạn chế sự khuếch tán do nhiệt.
5.7. Điện di miễn dịch
Điện di miễn dịch đợc thực hiện trong gel agarose trên một lam kính hoặc trên phim nhựa, cho phép phân tích đồng thời nhiều mẫu thử. Kỹ thuật này kết hợp 2 giai đoạn kế tiếp:
- Điện di trong một trường thứ nhất: các protein được phân chia bởi điện di bắt đầu từ một hố nhỏ được đục trong gel agarose. Vì thế, mỗi protein được phân chia có hình ellip kéo dài.
- Khuếch tán miễn dịch trong một trờng thứ hai: trong một máng được đục song song với hớng của giai đoạn một, ngời ta đặt một kháng huyết thanh vào đó, nó sẽ khuếch tán vuông góc với máng. Các protẹin đã phân chia cũng khuếch tán bắt đầu từ vết thu đợc sau điện di. ở điểm cân bằng, sẽ xuất hiện một cung kết tủa. Cung này dễ nhận thấy khi nhuộm màu protein.
Đây là một phơng pháp phân tích rất hay dùng vì có khả năng phân chia cao. Nó có thể phân chia đợc gần 30 protein huyết thanh nhờ một kháng huyết thanh cừu kháng protein huyết thanh người. Những bất thường về số lợng và chất lợng protein huyết thanh của bệnh nhân có thể phát hiện dễ dàng bằng cách so sánh với một huyết thanh chứng bình thường đợc đặt đối xứng qua máng và cùng chạy. Để đánh giá chính xác các bất thường, người ta dùng kháng thể monoclon đặc hiệu.