Ngày nay, kỹ thuật miễn dịch dùng trong lâm sàng rất phong phú và đa dạng, vì thế mà các nhà lâm sàng rõ ràng là cũng nên có một số kiến thức nhất định về những kỹ thuật này, tối thiểu là cũng phải nắm được độ chính xác và độ tin cậy của kỹ thuật mà mình yêu cầu. Mục đích của chúng tôi trong chương trình này là nhằm giới thiệu những nguyên lý của các kỹ thuật miễn dịch lâm sàng đang được dùng phổ biến ở các cơ sở chẩn đoán và điều trị trên thế giới; đồng thời nêu lên một số nhận định của chúng tôi về những khó khăn trong khi phân tích kết quả đạt được.

Các thử nghiệm la-bô cũng được phân cấp độ tùy theo giá trị của chúng đối với từng trường hợp bệnh nhân cụ thể. Một số thử nghiệm được xếp vào loại cần thiết (essential) cho chẩn đoán hoặc theo dõi, một số thuộc loại tùy chọn (optional) nhưng có ích và số còn lại là loại chỉ để nghiên cứu. Một số xét nghiệm sẽ trở nên vô ích nếu chúng ta yêu cầu không đúng lúc, đúng chỗ. Các phân chia như trên của chúng tôi sẽ giúp các nhà lâm sàng có được chỉ định thích hợp cho mỗi thử nghiệm. Trong chương này, chúng tôi cũng không mô tả chi tiết phương pháp tiến hành kỹ thuật vì đó là nội dung của các sách chuyên đề về kỹ thuật miễn dịch mà chúng tôi dự kiến cho xuất bản trong nay mai.

Có ba nhóm kỹ thuật đã được xây dựng để đánh giá năng lực miễn dịch của các bộ phận riêng lẻ trong đáp ứng miễn dịch. Các yếu tố dịch thể như immunoglobulin, kháng thể, các thành phần bổ thể và các protein đặc hiệu khác đều có thể định lượng được chính xác. Giới hạn bình thường cho các yếu tố này sẽ được trình bày và kết quả sẽ được phân tích theo lâm sàng một cách dễ hiểu. Ngược lại, các thử nghiệm về các thành phần tế bào thì khó thực hiện hơn cũng như khó phân tích hơn. Chưa có kỹ thuật nào được gọi là chuẩn đối với phương pháp đánh giá tế bào, vì thế mà ở mỗi la-bô người ta thường làm một cách khác nhau. Để cho việc phân tích kết quả được tốt, cần phải có liên hệ chặt chẽ giữa các nhà miễn dịch và nhà lâm sàng. Các thử nghiệm in vivo nhằm đánh giá cả yếu tố dịch thể lẫn tế bào có giá trị khi khảo sát thiếu hụt miễn dịch và quá mẫn nhưng rất khó chuẩn hóa.

12.1. Định lượng immunoglobulin và các protein đặc hiệu khác

Định lượng immunoglobulin (Ig) tỏ ra rất cần thiết đối với những bệnh nhân nhiễm trùng nặng hoặc lặp đi lặp lại nhiều lần cũng như đối với những bệnh nhân rối loạn tăng sinh lympho. Việc định lượng nhiều lần có thể giúp chúng ta phân biệt thiếu hụt miễn dịch thoáng qua và thường xuyên cũng như giúp chúng ta theo dõi điều trị trong bệnh tăng sinh lymphô. Việc định lượng này tỏ ra có ích đối với các bệnh cảnh có giảm gammaglobulin máu như nhiễm trùng HIV, bệnh gan và SLE.

Hình 12.1. Sơ đồ minh họa các điểm cân đối của tỉ lệ kháng nguyên – kháng thể để có thể tạo tủa. Khi thừa kháng nguyên hoặc kháng thể thì ít liên kết chéo xảy ra nên tủa rất ít hoặc không có.

Kỹ thuật thường được dùng phổ biến nhất là miễn dịch kết tủa (immunoprecipitation). Tủa miễn dịch được hình thành khi kháng nguyên và kháng thể kết tủa tương ứng cùng hiện diện với nồng độ tương ứng tối ưu (cân bằng) (Hình 12.1). Miễn dịch khuyếch tán đơn (single radial imminodifusion, RID) là kỹ thuật được Mancini sử dụng và mô tả đầu tiên. Kỹ thuật này sử dụng một kháng huyết thanh này được hòa tan vào thạch đun lỏng, và hỗn hợp thạch-kháng huyết thanh được đổ rải đều lên một phiến kính đặt trên mặt phẳng ngang. Sau khi thạch đông, người ta đục các lỗ tròn trên thạch và cho huyết thanh cần đo hoặc huyết thanh chứng vào. Kháng nguyên, mà trong trường hợp này là immunoglobulin, sẽ khuyếch tán theo hướng ly tâm từ các lỗ ra vùng thạch có chứa kháng huyết thanh chung quanh. Bởi vì nồng độ kháng thể (kháng huyết thanh trong thạch) cố định nên khi kháng nguyên trong lỗ khuyếch tán thì nồng độ giảm dần cho đến khi có tỷ lệ thích hợp với nồng độ kháng thể trong thạch thì một vòng tủa sẽ hình thành. Đối với mỗi mẻ người ta làm ba lỗ chứa kháng nguyên với nồng độ biết trước để vẽ thành đường chuẩn (Hình 12.2).

Hình 12.2. Đường chuẩn dùng trong định lượng protein đặc hiệu bằng

khuyếch tán đơn, kỹ thuật Mancini.

Lỗ 1-3 chứa nồng độ, chuẩn đã biết của loại protein muốn đo. Trên trục tọa độ là đường chuẩn đã được vẽ. QC =  quality control, kiểm tra chất lượng.

Điều không thuận lợi của phương pháp này là vòng tủa phải mất 48 giờ mới ổn định. Phương pháp này tương đối nhạy (giới hạn dưới là 5 mg/lít) và đáng tin cậy (hệ số biến động giữa các kỹ thuật viên thành thạo là 3-10% với điều kiện kháng huyết thanh tốt). Người ta đã xây dựng một phương pháp cải tiến khác để có thể đọc kết quả nhanh trong vòng 6 giờ, nhưng phương pháp này kém chính xác hơn.

Ở nồng độ thấp, phức hợp miễn dịch tồn tại dưới dạng những hạt rất nhỏ trong nhũ dịch và có thể làm tán sắc ánh sáng. Sự tán sắc này có thể đo được với một cái máy gọi là máy đo độ đục (nephelometer), trong đó phức hợp miễn dịch được để tự nhiên như vậy khi đo; hoặc dùng một máy đo khác gọi là máy phân tích ly tâm (centrifugal analyzer), trong đó lực ly tâm làm cho phức hợp miễn dịch được hình thành nhanh hơn. Cả hai phương pháp đòi hỏi không được có các chất bẩn gây tán sắc như nhũ bọt khí hoặc hạt nhũ tương lỏng. Khi nồng độ kháng thể cố định, độ cản tia sẽ tỉ lệ thuận với nồng độ kháng nguyên. Đây là một phương pháp thực hiện nhanh và dễ tự động hóa; ta có thể có được kết quả chính xác sau khi lấy máu 1-2 giờ.

Bảng 12.1. Một số protein có thể định lượng bằng khuyếch tán đơn.

Cả miễn dịch khuyếch tán đơn và đo độ đục đều có thể dùng để định lượng nhiều loại protein trong huyết thanh, nước ối, dịch não tủy, nước bọt và dịch tiêu hóa (Bảng 12.1). Các huyết thanh chuẩn dùng để vẽ đường chuẩn hoặc thang chuẩn phải theo đúng quy định của Tổ chức Y tế Thế giới. Hiện nay trên thế giới đã có đủ huyết thanh chuẩn cho các phép đo protein huyết thanh thường quy, với điều kiện lượng protein đó phải lớn hơn 5mg/lít trong dịch đo. Mỗi phòng thí nghiệm của mỗi bệnh viện phải tự mình xác định giới hạn bình thường cho mỗi protein và giới hạn này thay đổi tùy theo phương pháp, kháng huyết thanh, huyết thanh chuẩn được dùng cũng như tùy theo nhóm dân tộc mà ta khảo sát. Giới hạn bình thường của đa số protein cũng thay đổi tùy theo tuổi, nhất là ở trẻ em.

Chúng ta cũng có thể đo nồng độ của IgG và albumin trong dịch não tủy; là bởi vì albumin không được tổng hợp trong não nên tỉ lệ IgG/albumin là một chỉ số gián tiếp nói lên mức độ IgG dịch não tủy được tế bào lympho tổng hợp ở não. Ngày nay đây là một thử nghiệm cần thiết để khảo sát nhiễm trùng hoặc tình trạng mất myelin của hệ thần kinh trung ương.

   Kỹ thuật khuyếch tán miễn dịch điện di (electroimmunodifusion), mà người ta thường gọi là điện di “hỏa tiễn”, có độ chính xác và độ nhạy cao hơn khuyếch tán đơn, giới hạn dưới của kỹ thuật là 1mg/lít. Protein khảo sát được cho chạy trong một điện trường vào trong gel chứa kháng thể tương ứng (Hình 12.3). Giả sử chúng ta đã đạt đến  điểm ổn định cuối cùng, chúng ta thấy có sự tương quan tuyến tính giữa chiều cao của cột tủa với nồng độ của kháng nguyên. Trong khi thời gian cho chạy điện di không ngắn hơn bao nhiêu so với khuyếch tán đơn tự nhiên, phương pháp này không thích hợp cho việc định lượng Ig vì đây là các protein kém tích điện nên di chuyển chậm khi điện di.

Có nhiều kháng thể đơn clôn không cho tủa với kháng nguyên tương ứng, điều này được giải thích là do có quá ít epitope có thể cho phản ứng với kháng huyết thanh. Tuy nhiên, cũng có các hỗn hợp kháng thể đơn clôn có thể tạo tủa miễn dịch; và các tiểu lớp của Ig đã được đo theo cách này, ví dụ như trong trường hợp định lượng IgG2 để chẩn đoán thiếu hụt IgG2.

Hình 12.3. Sơ đồ minh họa hình ảnh điện di miễn dịch hỏa tiễn.

Độ cao của cung tủa tỉ lệ thuận với nồng độ kháng nguyên. Tủa có thể nhìn thấy rõ sau khi nhuộm. Các nồng độ chuẩn được dùng để vẽ đường chuẩn, từ đó tính được các nồng độ chưa biết dựa vào chiều cao x đo được

12.2. Khảo sát định tính immunoglobulin

12.2.1. Huyết thanh

Tất cả các mẫu huyết thanh người lớn được đề nghị định lượng Ig nên được sàng lọc trước bằng điện di protein huyết thanh để tìm sự hiện diện của paraprotein (các dải đơn clôn).

Nền đỡ thường dùng nhất là một màng cellulose acetate. Tấm màng ướt được cho vào hộp điện di và những dung giấy thấm giúp cho việc cung cấp liên tục dung dịch đệm. Các mẫu huyết thanh được cho lên màng ở phía cực âm và một dòng điện được cho qua màng trong 45 phút. Sau đó lấy màng ra, và các dải protein có thể thấy được nếu chúng ta cho nhuộm với thuốc nhuộm thích hợp (Hình 12.4). Chúng ta luôn nhớ phải cho chạy một mẫu huyết thanh bình thường song song với huyết thanh thử để dễ so sánh.

Những dải đơn clôn (dải M) lạ có thể xuất hiện ở một vị trí nào đó trên màng điện di và chúng ta cần tách chúng ra để khảo sát sâu hơn. Trên màng điện di có thể xuất hiện những “dải giả” (false band), đó có thể là sản phẩm của hemoglobin (thấy rõ khi mẫu nghiệm có màu hồng) hoặc của fibrinogen (khi mẫu là huyết tương hoặc là huyết thanh nhưng máu để đông không được hoàn toàn). Do có nhược điểm là các IgG đã bị tủa trong những mẫu đông lạnh có thể đọng lại tại gần vị trí lỗ chứa mẫu. Do đó, điều quan trọng khi làm xét nghiệm này cần phải gửi mẫu nghiệm đi sớm và máu phải đông hoàn toàn.

Hình 12.4. Nguyên lý của điện di protein huyết thanh

Các dải M có thể định lượng bằng một dụng cụ gọi là mật độ kế (densitometer); dụng cụ này đọc được độ đậm đặc của thuốc nhuộm bắt màu vào các dải và cho ta một biểu đồ tương ứng với các dải điện di (Hình 12.5). Tỉ lệ của mỗi loại protein riêng được tính thành phần trăm so với tổng lượng protein có được trong mẫu nghiệm; tỉ lệ bách phân này có thể chuyển ra số lượng tuyệt đối (g/lít) bằng cách tính đơn giản khi ta biết được nồng độ của protein toàn thể trong huyết thanh. Đo mật độ là một phương pháp quan trọng để định lượng protein trong các dải đơn clôn, nhất là khi chúng ta khảo sát các mẫu kép có lẩn nhiều immunoglobulin đa clôn.

Hình 12.5. Phân tích điện di protein bằng mật độ kế để định lượng dải M (A= albumin)

Khi một giải M được phát hiện trên điện di protein, mẫu huyết thanh đó cần phải chạy điện di miễn dịch hoặc làm phản ứng cố định bổ thể để xác định bản chất của dải. Nguyên tắc của điện di miễn dịch cũng giống như điện di protein huyết thanh nhưng người ta dùng gel thạch để làm chất nền. Sau khi tách các thành phần protein huyết thanh bằng điện di, một đường rãnh sẽ được cắt giữa các lỗ chứa huyết thanh và kháng huyết thanh đặc hiệu được cho vào rãnh này (Hình 12.6); những protein nào có phản ứng với kháng huyết thanh đặc hiệu sẽ cho ta một cung kết tủa. Sau 12-24 giờ, các protein không tủa sẽ được rửa sạch khỏi gel và các cung tủa được đem nhuộm để dễ thấy và đọc kết qủa. Trong các la-bô miễn dịch của các bệnh viện hiện nay, người ta thường dùng các huyết thanh đặc hiệu cho IgG, IgM, IgA hoặc các tiểu lớp của chúng, cho các chuỗi nhẹ kappa và lambda tự do cũng như cố định trong công tác chẩn đoán. Các immunoglobulin đa clôn bình thường cho ra những tủa dài, trơn láng khi phản ứng với  kháng huyết thanh đặc hiệu trong phương pháp xét nghiệm này. Một protein đơn clôn thì cho một cung tủa dứt khoát và gãy gọn hơn.

Hình 12.6. Nguyên lý của điện di miễn dịch. (b là hình phóng đại của a)

Để định tính một giải M người ta có thể cùng phương pháp cố định miễn dịch (immunofixation). Nhiều mẫu của huyết thanh thử trước hết được cho điện di trên celluose acetate hoặc gel thạch (Hình 12.7). Sau đó, kháng huyết thanh đặc hiệu đối với IgG, IgA, IgM hoặc các tiểu lớp của chúng cũng như đối với các chuỗi kappa và lambda cố định được cho tác dụng với các mẫu nghiệm đã điện di bằng cách nhúng màng cellulose acetate vào từng loại kháng huyết thanh (đối với trường hợp điện di trên màng  cellulose aceteat) hoặc cho từng loại kháng huyết thanh phủ lên mặt gel thạch đã điện di (đối với trường hợp đã điện di trên gel thạch). Sự kết tủa (tức cố định miễn dịch) của protein M sẽ thu được sau khoảng 2 giờ ủ. Còn các protein không được cố định (tức không tạo tủa) sẽ rửa sạch khỏi gel và các giải tủa được đem nhuộm để đọc. Phương pháp cố định miễn dịch nhạy hơn và thực hiện nhanh hơn điện di miễn dịch.

Hình 12.7. Định tính một dải M bằng phương pháp cố định miễn dịch.

Trong ví dụ này, dải M được tìm thấy trên giấy cellulose acetate là một Ig thuộc týp k

Trong trường hợp không có bất thường chuỗi nặng, kháng huyết thanh chuỗi nhẹ tự do (tức không phản ứng với chuỗi nhẹ “cố định” vào chuỗi nặng) sẽ cho chúng ta biết giải M có phải là của chuỗi nhẹ đơn clôn tự do hay không. Rất hiếm khi có một giải M phản ứng với kháng huyết thanh đặc hiệu chuỗi nhẹ “cố định” mà không phản ứng với chuỗi nhẹ “tự do” cùng týp; và nếu điều đó xảy ra thì dải M là một paraprotein IgD hoặc IgE, bởi vì IgG, IgA và IgM đã được loại trừ trên gel đầu tiên. Một bất thường xảy ra với chỉ kháng huyết thanh chuỗi nặng nói lên một bệnh chuỗi nặng hiếm gặp.

Sự tăng cao hàm lượng immunoglobulin huyết thanh buộc chúng ta phải đo độ quánh huyết thanh tương đối; kỹ thuật này đòi hỏi nhiều thời gian đủ cho một thể tích huyết thanh đã cho đi qua một ống mao quản, và so sánh với thời gian cho nước đi qua. Độ quánh huyết thanh tương đối bình thường có trị số từ 1,4 - 1,8. Triệu chứng lâm sàng của tăng độ quánh xuất hiện khi trị số này vượt quá 4,0.

Nếu như huyết thanh còn mới, sự lắng đọng nhiều protein ở phần gốc điện di nói lên khả năng hiện diện của cryoglobulin. Cryoglobulin là những immunoglobulin có thể chuyển thành dạng tủa, dạng gel hoặc kết tinh khi gặp nhiệt độ lạnh. Độ trầm trọng của triệu chứng, mà chủ yếu là ở da, phụ thuộc vào nồng độ cryoglobulin và nhiệt độ khi tủa lạnh xuất hiện. Nếu trên lâm sàng có dấu hiệu nghi ngờ về cryoglobulin, khi lấy máu xét nghiệm cần lấy máu tươi trực tiếp vào ống tiêm đã làm ấm và chuyển cho phòng xét nghiệm trong nhiệt độ ẩm, mẫu máu này khi cho đông cũng như khi tách huyết thanh đều phải được tiến hành 37^oC. Mẫu huyết thanh sau đó được để ở 4^oC. Tủa sau đó được hòa tan bằng cách cho làm nóng trở lại 37^oC và đem xét nghiệm để tìm các thành phần protein cấu tạo bằng điện di miễn dịch hay cố định miễn dịch.

12.2.2. Nước tiểu

Xét nghiệm nước tiểu là điều cần thiết trong trường hợp bệnh đa u tủy, trong một số bệnh khác có thấy dải M trong huyết thanh khi điện di, trong thiếu máu giảm gammaglobulin không rõ nguyên nhân và trong nhiễm tinh bột.

Sự tổng hợp immunoglobulin bình thường đi kèm với sự sản xuất một lượng thừa chuỗi nhẹ đa clôn tự do. Các chuỗi nhẹ này được bài tiết ra nước tiểu và chúng ta có thể phát hiện chúng dưới dạng vết ở tất cả mọi người. Bệnh nhân bị tổn thương thận thì sẽ tiết một lượng lớn chuỗi nhẹ tự do đa clôn trong nước tiểu.

Chuỗi nhẹ đơn clôn tự do (tức protein Bence Jones) đã được đặt tên của người đầu tiên mô tả tính chất nhiệt học đặc biệt của nó là kết tủa khi cho hâm nóng dung dịch lên đến 56^oC, nhưng nếu cho nóng hơn thì tủa lại tan ra. Tuy nhiên, phương pháp phát hiện cổ điển này chỉ phát hiện được khoảng 40% chuỗi nhẹ tự do trong nước tiểu. Cả phương pháp thường qui định lượng protein nước tiểu toàn phần lẫn thử nghiệm Clinistix đều không thể phát hiện chuỗi nhẹ tự do. Hiện nay, xét nghiêm thường qui đối với trường hợp nghi ngờ có protein Bence Jones nước tiểu gồm 3 giai đoạn: (1) cô đặc nước tiểu; (2) điện di cellulose acetate để tìm sự hiện diện của dải M; và (3) cố định miễn dịch hoặc điện di miễn dịch để xác nhận dải M được cấu tạo bởi chuỗi nhẹ kappa đơn clôn hoặc chuỗi nhẹ lambda đơn clôn. Sự bài tiết toàn bộ paraprotein của thận tổn thương có thể cho một kết quả dương tính giả, do đó chúng ta phải tìm bản chất của chuỗi nhẹ tự do của dãi M để xác nhận kết quả.

12.2.3. Dịch não tủy

Điện di dịch não tủy là một xét nghiệm có ích đối với chẩn đóan bệnh xơ hóa nhiều chỗ và các bệnh mất myelin khác. Cũng như trong huyết thanh, immunoglobulin của dịch não tủy cũng nằm ở vùng gamma. Nhưng ngược với huyết thanh, IgG thường tạo nên những dải thiểu clôn; có nghĩa là một vài dải rời rạc chứ không phải là một đám lan toả. Các dải thiểu clôn không thể phát hiện được bằng điện di thường qui dịch não tủy chưa cô đặc, do đó cần cô đặc dịch não tủy (80 lần) để có thể cho những dải thấy được. Độ nhạy của phương pháp  có thể được tăng cường bằng cách nhuộm đặc biệt như nhuộm bằng kháng huyết thanh đánh dấu enzyme hoặc bằng dung dịch có tăng cường bạc. Tuy nhiên, phương pháp nhạy và đáng tin cậy nhất là điện di dịch não tủy không pha loãng trên gel acrylamide. Môi trường gel này sẽ tách các protein theo trọng lượng phân tử cũng như theo điện tích. Sau đó gel được cố định và nhuộm như thông thường. Xét nghiệm này hiện chưa được dùng rộng rãi.

12.3. Kháng thể đối với kháng nguyên ngoại sinh

Trong nhiễm trùng, đáp ứng miễn dịch đối vi sinh vật có tính chất bảo vệ, làm cho cơ thể hồi phục sau khi bị nhiễm trùng, đồng thời tính miễn dịch còn giúp cơ thể chống lại sự tái nhiễm vi sinh vật đó. Tuy nhiên, bên cạnh tác dụng có lợi đó, một số kháng nguyên vi sinh vật lại có phản ứng chéo với kháng nguyên của cơ thể người, do đó kháng thể chống các kháng nguyên này có thể phản ứng với tự kháng nguyên và gây ra bệnh tự miễn. Đáp ứng quá mẫn đối với kháng nguyên ngoại sinh cũng có thể gây ra tổn thương mô.

12.3.1. Kháng thể chống vi khuẩn

Từ nhiều năm nay, người ta đã dùng phương pháp phát hiện kháng thể chống vi sinh vật để chẩn đoán nhiễm trùng do vi sinh vật đó gây ra. Sự hiện diện của kháng thể trong tuần hoàn chỉ chứng tỏ rằng cơ thể đã gặp kháng nguyên trước đó. Để chẩn đoán một nhiễm trùng cấp, chúng ta phải thấy được có sự gia tăng hiệu giá của kháng thể ở hai lần lấy máu xét nghiệm cách nhau hai tuần. Nếu cần có kết quả trả lời ngay, sự hiện diện với hiệu giá cao của kháng thể IgM đặc hiệu chứng tỏ đang có đáp ứng sơ cấp với vi sinh vật.

Phát hiện kháng thể chống vi khuẩn cũng là một điều cần thiết để khảo sát  thiếu hụt miễn dịch. Khả năng tạo kháng thể của người bệnh là một hướng dẫn tốt cho tính cảm nhiễm của người đó đối với nhiễm trùng là mức immunoglobulin toàn phần trong huyết thanh. Kháng thể chống các vi khuẩn chí đường tiêu hóa như E.coli có thể đo được với hiệu giá cao (<1/32) trên hầu hết người bình thường, còn những người bị thiếu hụt miễn dịch tiên phát thì không. Nếu bệnh nhân đã được chủng ngừa, việc tìm kháng thể chống độc tố uốn ván, độc tố bạch hầu và virus bại liệt cũng tỏ ra có ích. Việc phát hiện kháng thể  đối với kháng nguyên liên cầu tỏ ra quan trọng khi khảo sát các bệnh nhân mắc bệnh do phản ứng miễn dịch sau nhiễm liên cầu.

12.3.2 Kháng thể chống kháng nguyên không sinh sản

Một số kháng thể đối với kháng nguyên không sinh sản có thể gây ra tổn thương miễn dịch (quá mẫn). Loại xét nghiệm dùng trong trường hợp này phụ thuộc vào cơ chế tổn thương là tup I qua trung gian IgE, tup III qua trung gian IgM hay tup III qua trung gian IgG.

Trong hen ngoại sinh hay viêm mũi dị ứng, thử nghiệm bì rất có ích vì: (1) nó nói lên rằng đây là một phản ứng tup I qua trung gian của IgE; và (2) nó giúp phát hiện kháng nguyên liên quan. Các xét nghiệm la-bô thường có ích đối với những bệnh nhân có chống chỉ định đối với thử nghiệm bì, vì có rất nhiều bệnh nhân dương tính với cả thử nghiệm bì và xét nghiệm la-bô. Thử nghiệm lẩy da (prick test) là kiểu thử nghiệm trong đó chất đem thử được đưa vào da nhờ một đầu kim đưa xuyên qua một giọt chất đó trên mặt da và lẩy da lên (Hình 12.8); thử nghiệm này dễ làm . Thử nghiệm nội bì (intradermal test) gây đau nhiều hơn. Một điều cần lưu ý hơn khi làm các thử nghiệm này cũng như các thử nghiệm khác là chất đem thử phải là chất tinh khiết và đang có hoạt tính tốt, khi đó thử nghiệm mới cho kết quả tốt. Điều này đã gây rắc rối không ít cho thử nghiệm lẩy da trước đây mặc dù hiện nay đã có sẵn nhiều chế phẩm tương đối tinh khiết của nọc ong, phấn hoa, bọ bụi, lông thú và một số kháng nguyên thực phẩm như trứng, cá, các loại hạt vỏ cứng có nhân. Tuy nhiên, sự phân tích kết quả trong lâm sàng cần phải xem xét đối chiếu với các triệu chứng. Một bệnh nhân atopy thường cho thử nghiệm lẩy da dương tính với nhiều kháng nguyên, mặc dù chỉ có một loại kháng nguyên có thể gây ra triệu chứng lâm sàng.

Thử nghiệm kích thích (provocation test), tức thử nghiệm kích thích niêm mạc mũi hoặc niêm mạc phế quản bằng kháng nguyên, là một thử nghiệm khá phổ biến. Tuy nhiên, thử nghiệm này khá nguy hiểm nên cần phải được tiến hành trong bệnh viện bởi những thầy thuốc có kinh nghiệm. Thử nghiệm lẩy da mặc dù an toàn hơn nhưng cũng không phải là hoàn toàn không gây phản vệ; vì thế mà cũng nên được tiến hành dưới sự giám sát của thầy thuốc.

Ở các nước phát triển việc định lượng IgE toàn phần trên bệnh nhân nghi nhiễm ký sinh trùng tỏ ra có lợi. Định lượng IgE toàn phần còn giúp phân biệt cơ chế bệnh là có hay không vai trò trung gian của IgE. Định lượng IgE thường được thực hiện bằng phương pháp miễn dịch phóng xạ vì lượng IgE bình thường trong huyết thanh cực kỳ thấp (120-480 ng/ml). Lượng IgE thường được tính bằng IU (Đơn vị quốc tế, 1 IU = 2,4 ng IgE). Kỹ thuật đo thường dùng nhất đối với IgE là “kỹ thuật hấp thụ miễn dịch phóng xạ trên giấy” (paper radioimmunosorbent technique, PRIST). Thử nghiệm này, mặc dù giá thành hơi đắt, nhưng là một xét nghiệm nhậy, chính xác và rõ ràng.

Hình 12.8. Các thử nghiệm bì. (a) Thử nghiệm lẩy; (b) Thử nghiệm nội bì.

Kỹ thuật hấp thụ dị ứng phóng xạ (radioallergosorbent technique, RAST) (Hình 12.9) cho phép chúng ta định lượng được kháng thể IgE đặc hiệu kháng nguyên. Trong những kỹ thuật này, kháng nguyên được gắn lên những tấm đĩa nhỏ bằng giấy hoặc lên các hạt không hoà tan; sau đó cho huyết thanh thử vào và chỉ những kháng thể IgE nào phản ứng với kháng nguyên này mới còn giữ lại sau khi rửa. Kháng thể IgE đặc hiệu này sẽ được phát hiện bằng kháng thể thứ cấp có đánh dấu phóng xạ. Kết quả của thử nghiệm RAST hoàn toàn phù hợp với kết quả của thử nghiệm bì nhưng đắt nên ít được dùng trong trường hợp thử nghiệm bì bị chống chỉ định hoặc không có lợi. Những bệnh nhân thích hợp cho thử nghiệm này gồm có trẻ nhỏ bị viêm da nặng, trẻ nhỏ đang dùng các thuốc gây biến đổi phản ứng da như kháng histamine, người có khả năng bị phản ứng nặng nếu làm phản ứng bì và một số bệnh nhân dị ứng thức ăn.

Kháng thể kết tủa đối với kháng nguyên đặc hiệu thường là IgM hoặc IgG. Để chẩn đoán các bệnh viêm phế nang dị ứng ngoại sinh người ta thường dùng xét nghiệm tìm những kháng thể này. Kỹ thuật kết tủa được làm theo phương pháp Ouchterlony; đây là một phương pháp kém nhạy nhưng rẻ hơn nhiều so với kỹ thuật miễn dịch phóng xạ. Chiết xuất của các kháng nguyên nghi ngờ được đặt trong các lỗ ngoài (Hình 12.10) còn huyết thanh bệnh nhân được cho vào lỗ giữa. Sau nhiều ngày, tìm xem có tủa xuất hiện không. Hiện nay, trên thị trường người ta có bán một số kháng nguyên thường dùng, nhưng vẫn chưa có các sản phẩm tiêu chuẩn. Khi có một chất nghi ngờ là thủ phạm gây ra triệu chứng phổi cho bệnh nhân, chúng ta có thể dùng chất đó như một kháng nguyên để thử bằng thử nghiệm kết tủa với huyết thanh bệnh nhân.

Hình 12.9. Nguyên lý của phép đo kháng thể IgE đặc hiệu dị nguyên

Hình 12.10. Phát hiện kháng thể kết tủa trong viêm phế nang dị ứng ngoại sinh.

Bệnh nhân có kháng thể kết tủa chống albumin chim chứng tỏ đang bị bệnh phổi của người nuôi chim.

12.4. Phát hiện tự kháng thể

12.4.1. Trong huyết thanh

Ở các la-bô xét nghiệm thường quy, người ta thường dùng 4 phương pháp sau đây để phát hiện tự kháng thể lưu động: miễn dịch huỳnh quang (immunoflurescence), ngưng kết hồng cầu (hemagglutination), miễn dịch phóng xạ (hay miễn dịch enzym), và điện di ngược dòng (countercurrent electrophoresis). Mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm riêng. Miễn dịch huỳnh quang là kỹ thuật kém nhậy nhất trong số này, và kết quả phụ thuộc vào khả năng chủ quan của người đọc. Kỹ thuật ngưng kết hồng cầu có độ nhậy cao hơn nhưng lại mất nhiều thời gian. Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (radioimmunoassay, RIA) thì đòi hỏi sinh vật phẩm đắt tiền; cần có máy đo tia gamma hoặc beta và trang bị xử lý chất thải cũng là những thứ rất tốn kém. Kỹ thuật miễn dịch enzym (enzym-linked immunosorbent assay, ELISA) tránh được vấn đề tiếp xúc với tia phóng xạ nhưng lại đòi hỏi những dụng cụ rất chuyên biệt. Điện di miễn dịch ngược dòng thì rẻ và dễ làm nhưng tương đối kém nhậy.

12.4.1.1. Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

Đây là kỹ thuật thường được dùng để phát hiện nhiều loại tự kháng thể trong huyết thanh. Người ta thường dùng mô động vật để làm cơ chất nếu kháng nguyên hiện diện chung trên cả mô người lẫn mô động vật. Còn những tự kháng thể chỉ giới hạn ở mô người hoặc thậm chí chỉ ở một dòng tế bào người thì chúng ta sẽ không dùng mô động vật được. Vật phẩm mô dùng cho xét nghiệm này được cho đông lạnh ngay sau khi lấy khỏi cơ thể con vật và khi dùng thì đưa máy cắt lạnh và cắt ở -20­⁰ C.

Huyết thanh bệnh nhân được ủ với cơ chất (mô) trong 30 phút. Sau đó, những kháng thể không gắn vào mô sẽ được rửa sạch trước khi cho kháng thể cấp 2, có gắn chất đánh dấu (thường là huỳnh quang). Kháng thể đánh dấu sẽ liên kết với immunoglobutin của huyết thanh bệnh nhân đã gắn vào kháng nguyên trên cơ chất. Những vị trí có cố định kháng thể sẽ nhìn thấy được dưới kính hiển vi huỳnh quang (Hình 12.11).

Mỗi tự kháng thể sẽ được xác định bằng một kiểu bắt màu huỳnh quang đặc biệt trên một cơ chất đặc biệt. Sau khi huyết thanh được xác định là dương tính thì nó sẽ được định hiệu giá để xem kháng thể mạnh đến mức nào. Kết quả định lượng được tính bằng tỉ lệ hiệu giá (ví dụ 1/4, 1/8, 1/32,...) hoặc bằng IU (đơn vị quốc tế). Đa số các phòng thí nghiệm đều dùng kháng thể cấp 2 đặc hiệu IgG, do đó mà chỉ phát hiện được các tự kháng thể lớp IgG (tức kháng thể có ý nghĩa lâm sàng); tự kháng thể lớp IgM không quan trọng lắm. Tuy nhiên, kháng thể kháng nhân là một trường hợp ngoại lệ. Kiểu phát quang của kháng thể kháng nhân cũng có ích cho nghiên cứu lâm sàng, nhưng không có tính chẩn đoán. Hiện nay người ta vẫn không khuyến khích việc làm xét nghiệm “sàng lọc” đối với tự kháng thể. Chỉ những xét nghiệm mang lại lợi ích lâm sàng mới được yêu cầu.

Hình 12.11. Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

Việc phân tích kết quả của xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp phụ thuộc vào lớp kháng thể, hiệu giá của chúng, tuổi cũng như giới của bệnh nhân. Người già, nhất là phụ nữ thường có sản xuất tự kháng thể mà không có triệu chứng lâm sàng nào của bệnh tự miễn. Ngược lại, hiệu giá tự kháng thể cao ở người trẻ cho biết rằng một bệnh tiềm ẩn sẽ xuất hiện sau này.

12.4.1.2. Ngưng kết hồng cầu

Hồng cầu được dùng như một tế bào chỉ thị (indicator) vì chúng có thể “cụm” lại hoặc ngưng kết khi có kháng thể phản ứng chéo với kháng nguyên trên bề mặt của chúng. Kháng nguyên ở đây có thể là kháng nguyên của chính hồng cầu (như kháng nguyên ABO hoặc nhóm máu khác) hoặc kháng nguyên tinh khiết khác được gắn lên bề mặt hồng cầu. Người ta có dùng thử nghiệm ngưng kết hồng cầu hay không là phụ thuộc vào việc có sẵn kháng nguyên tinh khiết hay không. Phương pháp gắn nhìn chung không quá đơn giản trừ trường hợp của xét nghiệm tìm yếu tố thấp.

Yếu tố thấp (một kháng thể IgM phản ứng với IgG đóng vai trò kháng nguyên) sẽ cho phản ứng với IgG ngưng kết mạnh hơn là với IgG người còn nguyên bản. Do đó mà người ta đã làm cho IgG ngưng kết bằng cách cho chúng phản ứng với một kháng nguyên đã biết của chúng (tức hồng cầu cừu) hoặc bằng nhiệt. Đa số các phòng thí nghiệm dung hạt latex trong xét nghiệm tìm yếu tố thấp thường quy: IgG người được cho ngưng kết bằng nhiệt và gắn lên hạt latex và những hạt này sẽ ngưng kết khi gặp yếu tố thấp. Đây là một xét nghiệm nhanh và rẻ tiền, có thể dùng làm xét nghiệm sàng lọc đối với yếu tố thấp, nhưng nhược điểm của nó là hay cho phản ứng dương tính giả. Huyết thanh dương tính sau đó sẽ cho làm lại với xét nghiệm Waaler-Rose. Trong xét nghiệm này, kháng thể IgG thỏ (có những quyết định kháng nguyên chung với IgG người) được dùng để gắn lên hồng cầu cừu. Một liều dưới ngưng kết của kháng thể này được đem ủ với hồng cầu cừu và những hồng cầu chỉ thị “đã mẫn cảm” này sẽ được dùng để phát hiện yếu tố thấp là chất có khả năng làm ngưng kết những hồng cầu cừu đã mẫn cảm, chứ không làm ngưng kết hồng cầu nguyên bản. Hồng cầu không mẫn cảm được dùng để phát hiện kháng thể tự nhiên đối với hồng cầu cừu. Kết quả của phản ứng Waaler-Rose được tính bằng IU/ml hoặc tính thành tỉ số hiệu giá. Mặc dù có tên là yếu tố thấp nhưng yếu tố này không có tính chẩn đoán đối với bệnh viêm khớp dạng thấp mà chỉ có ích để theo dõi tiên lượng của bệnh.

12.4.1.3. Phương pháp miễn dịch phóng xạ (RIA) và miễn dịch enzym (ELISA)

Đây là những phương pháp rất nhậy dùng để phát hiện tự kháng thể với nồng độ thấp. Nhiều kỹ thuật đã được dùng và mỗi kỹ thuật điều có nhược điểm riêng của nó. Các enzym cũng có thể được dùng như các chất đánh dấu thay cho đồng vị phóng xạ trong RIA, và khi đó kỹ thuật được gọi là miễn dịch enzym (ELISA). Kỹ thuật này có vẻ nhạy hơn RIA.

Một khi chúng ta nghi ngờ bệnh nhân bị mắc SLE thì cần phải tìm kháng thể chống DNA chuỗi kép. Có thể phát hiện kháng thể  này bằng nhiều cách; những cách phổ biến nhất là dùng ¹⁴C-DNA, ¹²⁵I-DNA hoặc DNA đánh dấu phóng xạ trước đó bằng cách cho ¹⁴C-thymidine vào môi trường cấy để vi khuẩn tiêu thụ. Phương pháp này nhậy cho đến nỗi nhờ nó mà ta có thể phát hiện được mức liên kết DNA rất thấp trong những bệnh nhân khác ngoài SLE. Dùng ¹²⁵I-DNA có thể thưc hiện một thử nghiệm khác ít nhạy hơn, nhưng kết quả dương tính thì thường nói lên khả năng chỉ SLE hoặc viêm gan mạn hoạt động. DNA chuỗi kép dần dần tách ra thành DNA chuỗi đơn, do đó điều quan trọng là phải quan sát trị số liên kết chứng cho mỗi mẻ để biết mức độ tách ra của kháng nguyên là bao nhiêu. Người ta còn dùng một xét nghiệm khác là miễn dịch huỳnh quang trên ký sinh trùng Crithidia luciliae để tìm kháng thể kháng DNA chuỗi kép; kỹ thuật này cho độ đặc hiệu rất cao, nhưng lại tương đối kém nhậy vì không phải tất cả huyết thanh SLE đề phản ứng được trong xét nghiệm này. Gần đây, Tổ chức Y tế Thế giới đã cho công bố tiêu chuẩn thế giới về kháng thể kháng DNA chuỗi kép.

Một chất lấy từ nọc rắn có tên là a-bungarotoxin có khả năng cho liên kết rất mạnh với thụ thể của Acetylcholine trong dịch chiết xuất lấy từ cơ vân người. Chất này đã được sử dụng để làm xét nghiệm tìm kháng thể chống thụ thể acetylcholine (AChR). Alpha-bungarotoxin tinh khiết được đánh dấu bằng iod phóng xạ và cho kết hợp với chất chiết xuất từ cơ người. Kháng thể AChR sẽ phản ứng với chất này và có thể làm tủa bằng kháng huyết thanh kháng Ig người. Đây là một xét nghiệm rất nhậy; khoảng 90% bệnh nhân nhược cơ nặng cho kết quả dương tính khi làm xét nghiệm, đồng thời có rất ít trường hợp dương tính giả.

12.4.1.4. Điện di miễn dịch ngược dòng (countercurrent electro-phoresis)

Phương pháp này có thể được dùng để phát hiện kháng thể đối với nhiều loại kháng nguyên nhân chiết xuất được bằng nước muối và kháng nguyên bào tương mà ta gọi chung là “kháng nguyên nhân chiết xuất (ENA). Tuyến ức của bê hoặc thỏ được dùng làm nguồn cung cấp phần lớn kháng nguyên nhân, còn kháng nguyên Ro/SSA là kháng nguyên bào tương và được tách chiết từ lách người. Huyết thanh của mỗi cá thể thường chứa kháng thể chống lại nhiều kháng nguyên; nhưng mỗi tính đặc hiệu kháng thể thường chỉ thấy trên một nhóm nhỏ bệnh nhân mắc bệnh mô liên kết và vì thế mà kháng thể này có tính chẩn đoán đối với bệnh đó (Bảng 12.2).Tuy nhiên, vì kháng nguyên tinh khiết không phải đủ rẻ để có thể xét nghiệm thường xuyên nên người ta đang cố gắng sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để sản xuất. Riêng huyết thanh chứng có chứa kháng thể đã biết thì hiện đã có bán sẵn.

Bảng 12.2. Đọc kết quả về kháng thể chống các thành phần ENA

RTE = Tinh chất tuyến ức thỏ; HSE = Tinh chất lách người; CTE =Tinh chất tuyến ức bê.

Điện di miễn dịch ngược dòng tức là cho điện di kháng nguyên và kháng thể chạy ngược chiều về phía nhau. Với pH thích hợp, những kháng nguyên hơi có tính axít sẽ di chuyển nhanh chóng về phía anode còn kháng thể thì chạy về phía cathode; trong khi đó, nồng độ của chúng không thay đổi. Nếu huyết thanh bệnh nhân có chứa kháng thể thích hợp một đường tủa sẽ hình thành giữa các lỗ chứa kháng nguyên và kháng thể (Hình 12.12).

Hình 12.12. Điện di miễn dịch ngược dòng.

Điện di miễn dịch ngược dòng thường được dùng tốt nhất là để sàng lọc huyết thanh. Sau đó, tính đặc hiệu kháng nguyên của huyết thanh dương tính được xác định bằng kỹ thuật Ouchterlony (xem Hình 12.10). Chất chiết xuất kháng nguyên được đặt ở lỗ giữa, xung quanh là huyết thanh đã thử thấy dương tính và huyết thanh chứng đã biết tính đặc hiệu. Huyết thanh chứng và huyết thanh thử được đặt cạnh nhau: một đường tủa tương tự sẽ chứng tỏ rằng huyết thanh có tính đặc hiệu kháng nguyên tương tự.

12.4.2. Trong bệnh phẩm sinh thiết

Khảo sát bằng phương pháp hóa mô miễn dịch (immunohistochemical) trên các mẫu sinh thiết lấy từ mô bình thường và bệnh lý có thể cho thấy có lắng đọng immunoglobulin, bổ thể, và đôi khi có cả kháng nguyên. Immunoglobulin thấy ở đây có thể là kháng thể đến phản ứng với kháng nguyên đặc hiệu mô hay đặc hiệu cơ quan, hoặc có thể là trong phức hợp miễn dịch hình thành từ trước đến lắng đọng ở mô, một số phức hợp có chứa kháng nguyên ngoại sinh.

  Các mẫu sinh thiết để dùng cho xét nghiệm bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang không được cố định, và phải được chuyển ngay cho phòng thí nghiệm trong nhiệt độ lạnh. Sau đó, chúng sẽ được làm đông lạnh đột ngột và cắt mỏng; các lát cắt được rửa bằng nước muối để giảm độ nhuộm bẩn của nền trước khi cho ủ với kháng huyết thanh có cộng hợp (conjugate) thích hợp. Một mẫu song song được nhuộm với hematoxylin và eosin để xem hình ảnh hình thái học. Kỹ thuật này thường được dùng cho các mẫu sinh thiết thận, da và tủy xương và nó tỏ ra rất có ích cho chẩn đoán. Chỉ định sử dụng kỹ thuật này đã được đề cập ở các chương lâm sàng.

12.5. Khảo sát bổ thể

Các phương pháp dùng để khảo sát bổ thể huyết thanh được chia làm hai; kỹ thuật đo hoạt tính chức năng như gây tan máu, và kỹ thuật nhận diện bản chất kháng nguyên của mỗi thành phần bổ thể.

12.5.1. Đánh giá chức năng

Kỹ thuật gây tan máu là kỹ thuật được dùng phổ biến nhất trong các phòng thí nghiệm thường quy. Chỉ số thường được đánh giá là CH₅₀ (bổ thể gây tan máu toàn phần). Kỹ thuật này tính lượng huyết thanh cần thiết (tức lượng bổ thể cần thiết) để gây ly giải 50% số lượng hồng cầu mẫn cảm. Huyết thanh bệnh nhân luôn được định hiệu giá dựa theo một huyết thanh chuẩn. Giả sử rằng các mẫu huyết thanh được đưa đến phòng thí nghiệm ngay lập tức, thì kỹ thuật này cho kết quả rất nhạy và đáng tin cậy. Đây là một xét nghiệm cần thiết nếu chúng ta nghi ngờ bệnh nhân bị thiếu hụt di truyền một thành phần bổ thể nào đó, tức là bệnh nhân thường bị nhiễm trùng lặp đi lặp lại hoặc bệnh nhân là thành viên của một gia đình bị SLE hay hội chứng giống SLE (SLE – like).

12.5.2. Xét nghiệm từng thành phần bổ thể

Định lượng C₃ và C₄ bằng phương pháp hóa miễn dịch là các xét nghiệm có ích nhất. Trên thế giới hiện nay đã sẵn có các huyết thanh chứng quốc tế. Định lượng các thành phần bổ thể khác có thể thực hiện được nhưng hiếm khi cần đến, trừ phi có trường hợp nghi ngờ bị thiếu các thành phần đó do di truyền thể hiện qua trị số CH_50­ giảm sút. Chúng ta cần phải định lượng chất ức chế C_1q (C_1qINH) nếu nghi ngờ bệnh nhân bị phù mạch (angioedema). Tuy nhiên, có điều chúng ta cần nhớ là tất cả các trị số đo được nói trên chỉ là những con số mang tính thời điểm, trong khi đó các thành phần này lại tác động như những protein pha cấp cho nên sự tổng hợp chúng gia tăng đáng kể trong viêm; hậu quả của sự tăng tổng hợp làm cho chúng ta không thấy khả năng tiêu thụ bổ thể và có thể chúng ta lại cho rằng lượng bổ thể vẫn bình thường. Điều này gợi ý với chúng ta rằng lúc đó cần phải định lượng thêm các protein pha cấp khác để xác định phản ứng pha cấp đang diễn ra vào thời điểm định lượng bổ thể.

Để có thể hiểu được vai trò của sự biến đổi lượng bổ thể trong các quá trình bệnh lý, chúng ta có thể xem xét các thành phần bổ thể theo 3 nhóm: (1) các thành phần sớm của con đường cổ điển (C_1, C₄ và  C_{2 ­}); (2) các thành phần sớm của con đường không cổ điển (Yếu tố B, D và P); và (3) các thành phần muộn chung cho cả hai con đường (C₃ đến C₉ ). Trong thực hành (Bảng 18.9), khi lượng C₃ và C₄thấp nhưng yếu tố B bình thường thì sự hoạt hóa chỉ xảy ra theo con đường cổ điển; còn nếu cả C_3, C₄ và yếu tố B đều thấp thì có lẽ con đường không cổ điển đang được hoạt hóa theo lối vòng cung phản hồi (feedback loop) (xem lại chương 1) hoặc do hoạt hóa đồng thời. Nếu lượng C₄ bình thường còn C₃ và yếu tố B thấp thì có nghĩa là đang có sự hoạt hóa của chỉ con đường không cổ điển.

Như vậy, chúng ta có thể thấy rằng việc đo C₃ và C₄  nhiều lần có thể giúp ích cho việc theo dõi các bệnh nhân bị mắc một số dạng bệnh viêm cầu thận, SLE và viêm mạch. Nếu chúng thấp khi mắc bệnh, thì có thể trở lại bình thường khi hồi phục, do đó, C₃ và C₄ cũng giúp ích cho việc theo dõi điều trị. Xét nghiệm bổ thể thường quy rất ít giá trị đối với đa số các bệnh viêm cấp và mạn tính (Bảng 12.3).

Bảng 12.3. Phân tích các biến đổi bổ thể trong bệnh lý

(Bt= Bình thường)

12.5.3. Phát hiện các sản phẩm phân cắt của C₃

Xét nghiệm này rất có ích trong trường hợp bệnh nhân bị sốc nội độc tố, tức là khi trong cơ thể có khả năng hoạt hóa C₃ theo đường không cổ điển. Độ di chuyển trên điện di của C₃ và các sản phẩm phân cắt của nó (ví dụ C₃dg) khác nhau. Đối với các mẫu huyết tương lấy từ bệnh nhân đã có phân cắt C₃ in vivo thì các sản phẩm phân cắt có thể phát hiện được trong huyết tương chống đông bằng EDTA, trong khi đó trong các mẫu huyết tương bình thường chỉ có thể phát hiện C₃ còn nguyên vẹn. Sự hiện diện của EDTA ngăn chặn được sự phân cắt xảy ra in vitro sau khi lấy máu tĩnh mạch.

12.5.4. Yếu tố viêm thận C₃ (C₃NeF)

Yếu tố viêm thận C₃ là một tự kháng thể chống C₃  hoạt hóa. Tự kháng thể này làm bền vững enzym C₃  convertase của con đường không cổ điển và cho phép sự phân cắt C₃ tiếp tục xảy ra. Người ta nghi ngờ có C₃ N_­eF trên những bệnh nhân có mức C₃ thấp không giải thích được; đây thường là những người mắc bệnh thận hoặc nhiễm trùng tái đi tái lại. Yếu tố này được phát hiện bằng cách cho huyết thanh bệnh nhân ủ với huyết thanh bình thường; cách này làm cho yếu tố viêm thận C₃  của bệnh nhân phân cắt C₃  trong huyết thanh bình thường. Và chúng ta đem hỗn hợp này cho định lượng C_3c.

12.6. Khảo sát phức hợp miễn dịch

Rất nhiều bằng chứng đã cho thấy rằng phức hợp miễn dịch đã tham gia vào cơ chế bệnh sinh của tổn thương mô trong nhiều bệnh của người. Việc tham gia gây triệu chứng lâm sàng của phức hợp miễn dịch thường được đánh giá bằng hai cách: cách thứ nhất là phân tích các hình ảnh tổn thương mô để tìm bằng chứng của sự lắng đọng phức hợp miễn dịch, và cách kia là tìm phức hợp miễn dịch trong huyết thanh và các dịch cơ thể.

Trong một số bối cảnh lâm sàng việc phát hiện phức hợp miễn dịch tỏ ra không cần thiết và sự hiện diện của phức hợp miễn dịch lưu động không đặc hiệu cho bất cứ bệnh phức hợp miễn dịch nào.  Các tổn thương do phức hợp miễn dịch gây ra có thể xuất hiện mà không thấy có phức hợp miễn dịch lưu động; và ngược lại chúng ta lại thường có thể tìm thấy phức hợp trong huyết thanh người bình thường. Phát hiện phức hợp lưu động có thể có ích cho việc đánh giá hiệu quả của thay huyết tương. Đối với tất cả những trường hợp nghi ngờ có vai trò bệnh sinh của phức hợp miễn dịch, chúng ta nên tiến hành khảo sát trực tiếp sinh thiết mô nếu được, và nhớ rằng khảo sát này không thể thay thế bằng thử nghiệm tìm phức hợp lưu động được.

Việc xét nghiệm phức hợp miễn dịch huyết thanh không phải bệnh viện nào cũng thực hiện. Hơn nữa, giữa các bệnh viện luôn có sự khác nhau rất lớn về kết quả đạt được vì thế mà việc chuẩn hóa là một điều kiện quan trọng trước khi đưa xét nghiệm vào thường quy xét nghiệm. Hiện nay, trên thế giới ta đã có bán những sản phẩm chuẩn cho những phòng thí nghiệm miễn dịch đặc biệt chuyên khoa. Nhưng dù sao, khi làm xét nghiệm này, các kết qủa phải được đánh giá trong phối hợp giữa la-bô và bác sĩ lâm sàng.

Có nhiều phương pháp phát hiện phức hợp miễn dịch lưu động, mỗi phương pháp điều có ưu điểm riêng. Nguyên lý của những phương pháp này là phát hiện immunoglobulin có trong phức hợp mà không cần chú ý bản chất của kháng nguyên là gì. Cơ sở của kỹ thuật kết tủa lạnh (cryo-precipitation) chưa được hiểu hoàn toàn và phương pháp này chỉ phát hiện được một số phức hợp nào đó. Những xét nghiệm phụ thuộc vào thụ thể bổ thể không phát hiện được phức hợp có mang kháng thể thuộc loại không cố định và hoạt hóa bổ thể. Những thử nghiệm đối với thụ thể Fc không phát hiện được những phức hợp chứa những immunoglobulin không phải là IgG. Ngoài ra, tất cả các phương pháp đều dễ bị gây trở ngại bởi những chất không phải là phức hợp miễn dịch. Và, hiện nay, chưa có cách nào để phân biệt những immunoglobulin kết tủa không đặc hiệu với phức hợp miễn dịch thật sự. Việc bảo quản huyết thanh không đúng cách, việc làm tan rồi làm đông huyết thanh nhiều lần có thể làm cho immunoglonulin kết tủa. Tuy vậy, qua nhiều báo cáo của các công  trình hợp tác của Tổ chức Y tế thế giới, người ta thấy rõ rằng có một số xét nghiệm (đặc biệt là xét nghiệm liên kết C1q, thử nghiệm conglutinin, thử nghiệm ức chế yếu tố thấp đơn clôn, xét nghiệm dùng tế bào Raji) giúp phân biệt được huyết thanh bình thường. Kết quả dương tính của những xét nghiệm này chứng tỏ có sự hiện diện của phức hợp miễn dịch lưu động trong máu bệnh nhân.

12.7. Khảo sát lymphô bào

Có ba kiểu xét nghiệm dùng để đánh giá tế bào: (1) đếm số lượng các loại tế bào; (2) thử nghiệm in vivo; và (3) đánh giá chức năng của từng loại tế bào.

12.7.1. Đếm số lượng tế bào lymphô

Chúng ta bắt đầu khảo sát được các tiểu quần thể tế bào lympho từ khi biết rằng chúng có mang các dấu ấn bề mặt khác nhau. Đếm số lượng tế bào lympho trong các tiểu quần thể T và B rất có ý nghĩa đối với các bệnh thiếu hụt miễn dịch và tăng sinh lymphô. Xét nghiệm này ngày càng được áp dụng cho bệnh nhân nhiễm HIV để đánh giá mức độ suy giảm miễn dịch và tiên lượng cũng như để theo dõi các liệu pháp chống virus thực nghiệm. Người ta đã đưa ra một sơ đồ đảm bảo chất lượng để chuẩn hóa dần xét nghiệm này.

Tất cả mọi đánh giá đối với tế bào lympho đều phải tiến hành với máu chống đông mới lấy và chỉ sau khi có ý kiến tham vấn của la-bô miễn dịch. Trong xét nghiệm này, chúng ta có thể dùng máu toàn phần hoặc tế bào lympho đã tách. Việc tách tế bào lympho từ máu toàn phần được thực hiện bằng cách đặt máu đã chống đông bằng heparin lên chất Ficoll có tỉ trọng thích hợp. Sau khi ly tâm, hồng cầu và bạch cầu múi và chìm vào lớp Ficoll để lại toàn bộ tế bào lympho và một vài monocyte trên bề mặt của lớp Ficoll. Lớp tế bào này có thể hút ra dễ dàng bằng ống hút và đem rửa sạch để dùng (Hình 12.13).

Tất cả đã sản xuất kháng thể đơn clôn để nhận diện các tiểu quần thể tế bào lympho T trong máu ngoại biên. Máu toàn phần hay tế bào lympho thuần khiết được ủ với kháng huyết thanh chuột đặc hiệu tương ứng và sau đó đem nhuộm với kháng thể cấp 2 chống Ig chuột đã được đánh dấu. Các tế bào dương tính có thể đếm được dưới kính hiển vi. Một cách khác là người ta cho lympho bào đã nhuộm đi qua một chùm tia laser và các tia sáng phát ra từ các chất đánh dấu trên tế bào sẽ được một cảm biến tiếp nhận. Các tín hiệu điện tử thu được sẽ giúp để phân tích các tiểu quần thể tế bào. Đó là nguyên lý của phương pháp gọi là phép đếm tế bào bằng máy (cytometry). Hiện nay trên thế giới đã có sẵn nhiều kháng huyết thanh đơn clôn dùng để nhận diện và đếm các loại kháng nguyên CD xuất hiện đặc trưng trên các loại tế bào khác nhau như T giúp đỡ/khởi động (CD4), T ức chế/gây độc (CD8). Có điều chúng ta cần lưu ý là khi kết quả được thể hiện bằng tỉ lệ CD4:CD8 thì kết quả này không có ý nghĩa lắm; vì tỉ lệ CD4:CD8 thấp có thể gặp trong hai trường hợp bệnh lý khác nhau xa, đó là suy giảm tế bào giúp đỡ và gia tăng tế bào ức chế. Do đó, kết quả nên được trình bày dưới dạng các con số tuyệt đối dựa vào số lượng lymphô toàn phần.

Hình 12.13. Quy trình tách tế bào lymphô ra khỏi máu toàn phần

Lymphô bào B hầu như chủ yếu được nhận diện qua sự hiện diện của immunoglobulin bề mặt là các phân tử được tổng hợp trong các tế bào này. Phương pháp phát hiện là kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp dùng kháng huyết thanh chống immunoglobulin người cộng hợp (conjugate) với chất huỳnh quang (fluorescein). Tế bào lympho được ủ với chất cộng hợp này, sau đó đem rửa và đọc vào kính hiển vi huỳnh quang hoặc máy đếm tế bào. Immunoglobulin bề mặt được nhìn thấy như một vòng nhẫn phát quang xung quanh tế bào. Với phương pháp này, số tế bào lympho B đếm được chiếm 4 – 12% tổng số tế bào lympho trong máu ngoại biên. Ngoài ra, người ta cũng đã bán sẵn các kháng thể đơn clôn khác đặc hiệu tế bào B để chúng ta dùng khi cần.

12.7.2. Phản ứng da quá mẫn muộn ( in vivo)

Có hai loại phản ứng da in vivo được dùng để phát hiện lympho bào T mẫn cảm đặc hiệu, đó là: thử nghiệm nội bì, dùng kháng nguyên tiêm vào lớp nội bì (xem Hình 12.8), và thử nghiệm áp: áp kháng nguyên lên da để cho hấp thụ qua da.

Thử nghiệm nội bì đã được nhiều người biết là phản ứng tuberculin (Mantoux). Dẫn xuất protein tinh khiết (PPD) của tuberculin là một chất chiết xuất từ Mycobacterium hominis. Phản ứng dương tính của thử nghiệm da quá mẫn muộn xuất hiện sau 48 giờ: chỗ tiêm đỏ và cứng nhưng không ngứa hay đau. Phản ứng có cường độ tối đa sau 72 giờ và nhạt dần sau nhiều ngày. Hình ảnh này có thể phân biệt dễ dàng với phản ứng Arthus, là phản ứng xuất hiện sau khi tiêm 12 – 24 giờ, có phù và đôi khi ngứa. Trên 75% quần thể người lớn cho kết quả dương tính đối với phản ứng tuberculin. Nếu phản ứng xảy ra mạnh thì có nghĩa là đang có nhiễm trùng mycobacterium hoạt động trong cơ thể và kết quả này rất có ích cho chẩn đoán những trường hợp đang nghi ngờ mắc lao; còn phản ứng âm tính thì nói lên rằng cơ thể trước đây chưa tiếp xúc với vi khuẩn lao hoặc hệ miễn dịch tế bào bị suy giảm, ví dụ như trong trường hợp sarcoidosis hoặc thiếu hụt miễn dịch.

Phản ứng bì cho biết rằng, trước đây bệnh nhân đã được mẫn cảm với kháng nguyên được thử hay chưa (do đó, kháng nguyên thử còn được gọi là kháng nguyên gợi lại). Để tránh khả năng phản ứng âm tính do chưa tiếp xúc, khi xét nghiệm tình trạng suy giảm miễn dịch người ta dùng một panel kháng nguyên thường gặp để thử. Panel này thường bao gồm PPD, Candida albicans, streptokinase-streptodornase, quai bị và trichophyton; hơn 95% người lớn bình thường đáp ứng với ít nhất là một trong những kháng nguyên này. Riêng đối với trẻ em thì có thể chúng chưa tiếp xúc với các kháng nguyên nói trên trong môi trường. Bởi vì chứng thiều hụt tế bào T tiên phát thường thể hiện vào tuổi trẻ em nên chúng ta có thể dùng thêm thử nghiệm DNCB (dinitro-choloro-benzene) để đánh giá. Bệnh nhân được cho mẫn cảm với DNCB bằng cách bôi lên da và 10 ngày sau thì cho thử thách lại với DNCB được hòa loãng nhiều lần. Với người bình thường thì phản ứng dương tính sẽ xuất hiện trong vòng 48 giờ với đỏ và cứng da.

Thử nghiệm áp là thử nghiệm nhất thiết phải dùng đến khi cần xác định kháng nguyên nào là nguyên nhân gây viêm da tiếp xúc. Một số kháng nguyên dễ dàng hấp thụ khi bôi lên da. Một số khác hấp thụ rất kém nên được cho lên giấy cellulose và dán vào da. Sự lựa chọn kháng nguyên phụ thuộc vào tiền sử tiếp xúc, và nhiều bệnh nhân có thể nhạy cảm cùng lúc với nhiều kháng nguyên. Nồng độ kháng nguyên dùng chủ yếu dựa vào kinh nghiệm và không có sản phẩm chuẩn. Thời gian để phản ứng dương tính xuất hiện phụ thuộc vào mức độ hấp thụ và có thể thay đổi từ 2 – 7 ngày. Để cho tiện, người ta thường đọc thử nghiệm áp sau 2 – 4 ngày. Kết quả được gọi là dương tính khi thấy có đỏ da, phù, ngứa, và cứng ở chỗ tiếp xúc kháng nguyên.

12.7.3. Các thử nghiệm chức năng

Các thử nghiệm chức năng in vitro đối với miễn dịch tế bào chỉ nên tiến hành khi các triệu chứng lâm sàng có gợi ý những bất thường của miễn dịch tế bào. Như vậy, có nghĩa rằng, những thử nghiệm này chỉ cần thiết đối với những trường hợp bị thiếu hụt miễn dịch; tuy nhiên chúng cũng có ích trong việc theo dõi điều trị bằng liệu pháp miễn dịch.

Khi tế bào lymphô được cho tiếp xúc với một chất kích thích nào đó, một số ít tế bào lymphô nhỏ sẽ đáp ứng bằng cách chuyển dạng thành các nguyên bào trong thời gian vài ngày. Quá trình này được gọi là chuyển dạng lymphô bào (lymphocyte transformation). Các chất kích thích gồm có ba loại (Bảng 12.4). Đáp ứng tăng sinh sau kích thích có thể đo được bằng kỹ thuật cho thâm nhập thymidine có đánh dấu phóng xạ vào DNA của tế bào lympho. Ức chế di tản bạch cầu (leukocyte migration inhibition, LMI) là một thử nghiệm dễ thực hiện hơn nhưng không được dùng làm xét nghiệm thường quy. Lymphô T sản xuất lymphokin khi được tiếp xúc với kháng nguyên mà chúng đã được mẫn cảm trước đây. Một trong những lymphokin này gây ức chế sự di chuyển của một số tế bào trung tính, chất này được gọi là yếu tố ức chế di tản bạch cầu và có thể định lượng in vitro. Các thử nghiệm chức năng này luôn đòi hỏi phương tiện tốn kém cũng như mất nhiều thời gian (Bảng 12.4). Ngoài ra, khi cần xét nghiệm trên tế bào sống thì mẫu máu đi xét nghiệm phải được chống đông và đưa ngay đến la-bô. Vì có sự khác nhau giữa các lô thí nghiệm cũng như vì chưa có sản phẩm chuẩn mà việc phân tích kết quả trở nên hết sức khó khăn. Tốt nhất nên cùng phân tích với chuyên gia ở phòng thí nghiệm miễn dịch.

Bảng 12.4. Các tác nhân gây chuyển dạng lymphô bào T

12.8. Đánh giá tế bào trung tính và tế bào mono

12.8.1. Đếm số lượng tế bào trung tính và tế bào mono

Số lượng tuyệt đối của các tế bào này trong máu có thể tính dễ dàng từ công thức máu.

12.8.2. Tạo “cửa sổ da”

Khả năng tập trung tế bào trung tính và tế bào mono tại ổ viêm phụ thuộc vào sự sản xuất các chất thu hút có tính hóa hướng động đối với các tế bào này cũng như khả năng các tế bào này có thể di chuyển về nơi có các yếu tố thu hút đó. Cả hai thành phần này đều có thể đánh giá được in vivo bằng cách tạo ra một chỗ trầy da tối thiểu (thường là ở cẳng tay). Tốc độ các tế bào đến xuất hiện tại nơi trầy da này có thể đánh giá được bằng cách thu thập tế bào bằng một tấm lam kính nhỏ đặt lên trên chỗ trầy da. Để cho việc thu thập tế bào viêm được chắc chắn hơn người ta thường bôi lên chỗ trầy một chất hóa hướng động (với số lượng định sẵn).

12.8.3. Thử nghiệm các chức năng in vitro

Tế bào trung tính có thể tách được từ máu toàn phần dùng phương pháp li tâm gradient tỉ trọng như đã mô tả trong tách lymphô, sau đó được làm cho thuần khiết bằng cách cho ly giải toàn bộ hồng cầu bị lẫn vào. Tế bào mono có thể thu hoạch được trong lớp giao diện (interface) cùng với lymphô bào (xem Hình 12.13) và tách riêng bằng cách cho bám dính lên bề mặt thủy tinh hoặc chất dẻo và rồi rửa tế bào lymphô đi. (Tế bào mono là những tế bào bám dính, khác với tế bào lymphô.)

Hóa hướng động là sự di chuyển có mục đích của tế bào về phía các chất thu hút mà thường là casein hoặc một peptid tổng hợp f-Met-Leu-Phe. Khả năng tạo ra tính hóa hướng động của huyết thanh bệnh nhân có thể khảo sát được bằng cách ủ huyết thanh tươi với nội độc tố. Các tế bào cần thử nghiệm sẽ được tách từ kích thích hóa hướng động bằng một màng siêu lọc (có lỗ rất nhỏ). Sau khi ủ, màng lọc được lấy ra, cố định và nhuộm. Khoảng cách tế bào di chuyển được qua màng lọc hướng đến kích thích có thể đo được dưới kính hiển vi quang học thường dùng.

Thực bào là chức năng ăn vật lạ của một tế bào nào đó. Khả năng ăn này có thể xác định được bằng cách ủ tế bào thực bào với các hạt trơ như hạt latex, hoặc vi khuẩn. Các hạt hay vi khuẩn bên trong tế bào thực bào có thể thấy được dưới kính hiển vi. Chúng ta có thể khuếch đại khả năng thực bào để dễ quan sát bằng cách cho opsonin hóa các hạt trước với huyết thanh bình thường rồi mới cho vào môi trường có tế bào thực bào. Đồng thời qua phương pháp thực bào này chúng ta cũng có thể đánh giá được khả năng opsonin hóa của huyết thanh bệnh nhân bằng cách làm ngược lại tức là sau khi cho hạt latex tiếp xúc với huyết thanh bệnh nhân, ta đưa chúng vào cho tế bào trung tính bình thường ăn.

Hoạt tính enzym nội bào (intracellular enzyme activity) có thể đánh giá được bằng thử nghiệm giết vi khuẩn (bacterial killing) hoặc bằng khả năng khử thuốc nhuộm (dye reduction). Một thử nghiệm khả năng diệt khuẩn nội bào chuẩn bao gồm ủ bạch cầu với vi khuẩn sống như tụ cầu vàng chẳng hạn. Sau khi ủ, tế bào được ly tâm và loại bỏ vi sinh vật ngoại bào. Vi khuẩn được ăn vào, nhưng chưa bị giết chết, được đánh giá bằng cách cho ly giải tế bào bằng nước cất và giải phóng vi khuẩn bên trong ra; những vi khuẩn này sẽ được nuôi cấy trên thạch dinh dưỡng để xem tỉ lệ vi khuẩn còn sống là bao nhiêu. Nếu khả năng thực bào vẫn bình thường thì số lượng vi khuẩn sống phản ánh mức độ giết nội bào.

Thử nghiệm nitroblue tetrazolium (NBT) giúp chúng ta đánh giá khả năng “ăn” của thực bào và khử thuốc nhuộm NBT từ màu vàng sang để chuyển sang màu xanh. Các tế bào phân lập được cho vào dung dịch chứa NBT. Sau khi ủ, tế bào được đem rửa rồi chiết xuất NBT đã được ăn vào bên trong tế bào và đo mức độ khử bằng quang phổ kế. Một cách khác là tế bào được quan sát dưới kính hiển vi và đếm số lượng bạch cầu múi có chứa các tinh thể xanh. Các tế bào thực bào chỉ có thể khử NBT nếu chúng được hoạt hóa. Số lượng tế bào hoạt hóa đó trong máu ngoại biên bình thường rất thay đổi; có người cho rằng số lượng tế bào hoạt hóa này sẽ tăng cao khi có nhiễm trùng vi khuẩn, nhưng điều này vẫn còn đang tranh cãi. Trong xét nghiệm cải tiến từ thử nghiệm trên có tên là “thử nghiệm NBT hoạt hóa”, người ta cho “mồi” tế bào trước bằng cách cho chúng tiếp xúc với một lượng nhất định nội độc tố trước khi cho tiếp xúc NBT. Thử nghiệm này có ưu điểm là không phụ thuộc vào sự hoạt hóa tế bào trung tính in vivo và có thể xem như một xét nghiệm sàng lọc dễ làm có thể dùng rộng rãi.

Khi làm thử nghiệm phát lân quang (chemiluminescence): tế bào trung tính (của người bình thường) sẽ phát ra một chùm tia sáng có độ dài sóng lớn khi được kích thích bởi những hạt được opsonin hóa. Thử nghiệm này giúp phát hiện khả năng opsonin hóa của huyết thanh một cách đáng tin cậy, nhưng kết quả thu được khi dùng tế bào trung tính của người bệnh thì khá thay đổi và đòi hỏi phải làm thêm xét nghiệm khác. Một ưu điểm của kỹ thuật này là có thể đánh giá huyết thanh bệnh nhân với ngay những vi sinh vật mà bệnh nhân đang nhiễm.

Kỹ thuật iode hóa protein cho phép đánh giá tính nguyên vẹn của cơ chế giết bằng myeloperoxidase - hydrogen peroxide. Enzym này có thể phát hiện được nhờ tính chất của nó chuyển iodua kali ¹²⁵I thành iodua ion có thể gắn vào protein nội bào. Tỉ lệ “¹²⁵I tự do/¹²⁵I gắn protein” cho phép đánh giá khả năng sản xuất enzym của tế bào trung tính.

12.9. Định typ HLA

Kháng nguyên bạch cầu người (HLA) là tên dành cho các kháng nguyên hòa hợp mô (ghép) chủ yếu ở người. Có nhiều kháng nguyên hòa hợp mô trên bạch cầu, trong đó kháng nguyên của hệ HLA là quan trọng nhất. Những kháng nguyên này hiện diện trên tất cả các mô của cơ thể, nhưng chúng ta chỉ dễ dàng định týp HLA trên các tế bào lympho máu ngoại biên vì chúng chỉ có mật độ đủ lớn trên những tế bào này. Khác với hệ thống ABO của hồng cầu, không có kháng thể anti-HLA tự nhiên trong cơ thể người. Các sinh phẩm dùng để định týp là kháng thể được sản xuất do quá trình miễn dịch xảy ra trong truyền máu hoặc thai kỳ. Thử nghiệm thường dùng nhất là thử nghiệm gây độc lympho bào (lymphocytotoxic test). Tế bào lymphô sống được tách từ máu ngoại vi bằng ly tâm gradient tỉ trọng như đã đề cập ở trên. Dung dịch tế bào sau đó được trộn với các huyết thanh định týp khác nhau, sau đó bổ thể (người ta thường dùng huyết thanh thỏ bình thường để làm nguồn cung cấp bổ thể) được thêm vào. Sau khi ủ một thời gian ở 37^oC, những tế bào được kháng thể nhận diện sẽ bị giết bằng phản ứng ly giải qua trung gian bổ thể. Tế bào chết được phát hiện hiện qua khả năng chúng không thể ngăn cản thuốc nhuộm xâm nhập. Nếu đa số (>90%) các tế bào bị giết bởi một kháng huyết thanh nào đó, thì điều đó có nghĩa rằng chúng ta đã mang HLA tương ứng nên đã bị kháng thể nhận diện.

Thử nghiệm này chỉ được tiến hành thường quy ở những trung tâm chuyên khoa chuyên định týp HLA cho các trường hợp ghép cơ quan. Kỹ thuật đòi hỏi khá nhiều thời gian, đắt tiền và trình độ kỹ năng phải cao cũng như phải có nhiều kinh nghiệm trong việc đọc kết quả. Do đó trước khi đề nghị làm kết quả xét nghiệm này, cần phải xin ý kiến tham vấn trước, và khi đã được nhất trí thì phải lấy máu chống đông và gởi ngay đến cho la-bô.

Hiện nay, việc định týp HLA được thực hiện bằng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) để phát hiện gen HLA. Kỹ thuật này tốn kém hơn nhưng có độ chính xác và độ nhạy cao hơn nhiều so với các kỹ thuật khác.

Khá nhiều bệnh cho thấy có sự phối hợp với những kháng nguyên HLA nhất định. Ví dụ, trong bệnh viêm đốt sống dính khớp, có hơn 90% bệnh nhân dương tính với HLA-B27, ngược với tỉ lệ thấp (8%) của HLA này trong nhân dân. Đây là bệnh duy nhất mà việc định týp HLA được xem là có ích cho chẩn đoán. Trong những bệnh khác, sự phối hợp với HLA tỏ ra yếu hơn nhiều. Hơn nữa, tần xuất gen (tính được qua “mức độ phổ biến” của kháng nguyên trong quần thể) người bình thường quá cao cho đến nỗi sự hiện diện của chúng không nói lên được gen đó có phối hợp với một bệnh nào đó sẽ xảy ra hay không.

12.10. Sản xuất kháng huyết thanh dùng cho các phòng thí nghiệm miễn dịch lâm sàng

Kháng huyết thanh được sử dụng trong những thử nghiệm nói trên thường được sản xuất trên động vật bằng cách cho tiêm kháng nguyên cần thiết. Trước đây kháng huyết thanh sản xuất trên động cơ thể chủ yếu là sản phẩm của đáp ứng miễn dịch đa clôn, có nghĩa là trong kháng huyết thanh có nhiều kháng thể được sản xuất từ nhiều clôn tế bào B khác nhau. Mặc dù các kháng thể này khác nhau về cấu trúc chi tiết của vùng biến đổi nhưng tất cả đều cho phản ứng với kháng nguyên tương ứng (người ta gọi đó là tính phản ứng đơn đặc hiệu).

Hình 12.14. Nguyên lý sản xuất kháng thể đơn clôn

Trong những năm vừa qua người ta đã tạo ra được một bước tiến quan trọng trong sản xuất kháng thể huyết thanh đó là sản xuất kháng thể đơn clôn, tức là kháng thể được sản xuất bởi chỉ một dòng tế bào, và do đó các phân tử kháng thể được sản xuất ra hoàn toàn giống nhau ở cả vùng thay đổi và vùng hằng định của chúng. Những kháng thể đơn clôn này chỉ phản ứng với một quyết định kháng nguyên nào đó trên kháng nguyên được dùng. Chúng ta biết rằng hỗn dịch tế bào lách của con vật được gây mẫn cảm, có chứa nhiều tế bào B chịu trách nhiệm sản xuất nhiều kháng thể chống nhiều epitope khác nhau trên kháng nguyên đưa vào. Những tế bào B này được cho liên hợp với một dòng tế bào u tủy không sản xuất kháng thể để tạo nên một tế bào lai mang khả năng bất tử của tương bào ác tính. Các tế bào lai sau đó được tách ra và chọn dòng (Hình 12.14). Việc nuôi cấy trên quy mô lớn có thể giúp cung cấp số lượng đáng kể các kháng thể tinh khiết và cho phản ứng với độ chính xác cao. Nhờ vào tiềm năng sử dụng cho chẩn đoán và điều trị mạnh, càng ngày người ta càng có nhu cầu sản xuất kháng thể đơn clôn người vì chỉ có những kháng thể này mới không tạo nguy cơ xảy ra phản ứng quá mẫn. Tuy vậy, việc sản xuất kháng thể đơn clôn người hiện nay vẫn còn gặp nhiều khó khăn về kỹ thuật.

12.11. Kỹ thuật DNA tái tổ hợp và miễn dịch lâm sàng

Những tiến bộ về sinh học phân tử trong những năm qua đã mở ra nhiều ứng dụng quan trọng trong chẩn đoán và điều trị các bệnh miễn dịch. Do vậy, những nhà miễn dịch học lâm sang cần phải hiểu những thuật ngữ và phương pháp mà những nhà sinh học phân tử đang sử dụng.

12.11.1. Kỹ thuật và thuật ngữ

Các enzym endonuclease hạn chế (restriction endonuclease) là những enzym lấy từ vi khuẩn có khả năng cắt chuỗi DNA tại một vị trí đặc biệt liên quan đến một trình tự nucleotid nhất định. Dùng những enzym này với những tính đặc hiệu khác nhau cho phép cắt chuỗi DNA thành từng đoạn, mà mỗi đoạn có chứa một gen đặc biệt cần tách ra khỏi phần còn lại của phân tử DNA (Hình 12.15).

Hình 12.15. Lập bản đồ gen bằng kỹ thuật Southern Blot

Trong kỹ thuật Southern blot, các đoạn DNA, sau khi được cắt bởi bằng endonuclease hạn chế, được cho điện di trên gel agarose, những đoạn nhỏ thì di chuyển xa hơn những đoạn lớn. Trong số những đoạn này sẽ có đoạn có chứa gen mà ta quan tâm. Bằng cách dùng chất kiềm ta có thể làm tách đôi các đoạn dsDNA ra thành các ssDNA. Sau khi blot các ssDNA sang giấy nitrocellulose, ta cho đoạn DNA chuỗi đơn mới được tách lai với một đoạn ssDNA bổ sung tương ứng đã đánh dấu. Sau khi rửa và quan sát dưới đèn đọc phát xạ (autoradiography) thấy có phát xạ ở vị trí nào thì đó là vị trí có chứa đoạn gen mà ta quan tâm.

Có nhiều bệnh di truyền, sự khuyết tật của gen không thể biết và việc tìm gen khuyết tật này cũng không thực hiện được. Trong trường hợp này, gen gây bệnh có thể liên kết chặt chẽ với vị trí nhận diện của một endo-nuclease hạn chế nào đó. Dùng các endonuclease đã biết để dò toàn bộ genome người có thể giúp tìm ra các vị trí endonuclease mới hoặc loại bỏ những vị trí đang tồn tại. Như vậy, những đoạn DNA tạo được do một enzym hạn chế nhất định sẽ có những chiều dài khác nhau trên những người khác nhau. Người ta gọi điều này là tính đa dạng về chiều dài đoạn hạn chế (restriction fragment length polymorphism, RFLP), và tính chất này được di truyền đơn giản theo kiểu Mendel. RFLP cung cấp cho ta một lượng lớn các dấu ấn liên kết (linkage marker) để tìm ra các gen gây bệnh trong gia đình, mà không cần phải biết gì về bản thân gen đó cả.

Kỹ thuật DNA tái tổ hợp (recombinant DNA technology) dựa vào việc sử dụng plasmid như các phương tiện để truyền các đoạn DNA lạ, ví dụ gen người. Plasmid là những mảnh DNA hình tròn, nhỏ, xuất hiện tự nhiên trong bào tương của vi khuẩn. Dùng một endonuclease đặc hiệu có thể mở vòng plasmid này và gắn vào đó một đoạn gen người, và như vậy là ta đã tạo ra một phân tử DNA lai (hybrid DNA) có chức năng sinh học riêng. Nếu sau đó plasmid đưa được vào một loại vi khuẩn nào đó (ví dụ E. coli) thì ta có thể cho nuôi cấy vi khuẩn để sản xuất ra một loại các bản sao đoạn DNA đã gắn vào plasmid đó. Kỹ thuật DNA tái tổ hợp thường được dùng để sản xuất các chế phẩm sinh học tính khiết sử dụng trong chẩn đoán hoặc điều trị hoặc một số mục đích sinh học khác.

12.11.2. Ứng dụng chẩn đoán

Kỹ thuật khuyếch đại DNA đã cung cấp cho chúng ta một phương tiện chẩn đoán trước sinh (prenatal diagnosis) chính xác đối với các bệnh di truyền. Vật phẩm dùng cho chẩn đoán là mẩu mô lấy được từ gai nhau, từ kỹ thuật soi thai (fetoscopy) hoặc chọc túi ối (amniocentesis). Kỹ thuật này cũng giúp chẩn đoán ở giai đoạn tiền lâm sàng những bệnh nhiễm sắc thể có thời kỹ khởi bệnh muộn, bệnh phụ nữ liên quan giới tính, kể cả những thiếu hụt miễn dịch di truyền.

Người ta ghi nhận rằng các thử nghiệm gen đang được sử dụng ngày càng nhiều cho việc chẩn đoán bệnh. Việc phát hiện ra hiện tượng tái sắp xếp (rearrangement) của các gen immunoglobulin và của gen thụ thể tế bào T (TCR gene) đã cung cấp cho chúng ta một công cụ mới để phân tích nguồn gốc của những tế bào lympho ác tính không mang các dấu ấn kinh điển của tế bào B và tế bào T, tìm nguồn gốc của tế bào ung thư trong bệnh bạch cầu tế bào dạng tóc (hairy cell leukemia) và những cơn tăng dữ dội các nguyên bào trong bệnh bạch cầu tủy mạn. Ngoài ra, thử nghiệm gen cũng giúp ta phân biệt các bệnh tăng sinh lympho đa clôn và đơn clôn.

12.11.3. Ứng dụng điều trị

Kỹ thuật DNA tái tổ hợp đã mang lại nhiều tiến bộ trong điều trị thông qua việc tổng hợp các hợp chất sinh học hoặc liệu pháp gen.

Sinh tổng hợp có được tiến hành bằng cách gắn một gen người vào một plasmid làm vật truyền và sau đó cho nhân lên thành clôn. Có nhiều loại hormone (ví dụ insulin) và thuốc điều hòa miễn dịch (ví dụ interferon) đã được tổng hợp theo cách này. Một ứng dụng quan trọng của phương pháp này sẽ là ứng dụng trong sản xuất vắc xin. Một khi chúng ta đã xác định được những kháng nguyên vi khuẩn có khả năng gây miễn dịch bảo vệ thì chúng ta có thể tạo clôn được với những gen tương ứng. Một vắc-xin tái tổ hợp đã được sản xuất và dùng phổ biến là vắc xin viêm gan B. Hiện nay các nhà nghiên cứu đang cố gắng để tìm ra những vắc xin có hiệu quả khác nhằm chống lại các bệnh nhiễm trùng phổ biến trên thế giới như vắc-xin sốt rét và HIV.

Một mục đích của công nghệ gen là thay thế được những gen bị khiếm khuyết trong cơ thể con người. Liệu pháp gen hiện đang còn nhiều tranh cãi nhưng những rối loạn miễn dịch như thiếu hụt adenosine deaminase hoặc purine nucleoside phosphorylase đang là những ứng cử viên quan trọng đầu tiên cho việc sử dụng liệu pháp này để điều trị.

nguồn : benhhoc.com